The Laboratory for Functional Glycomics
质谱鉴定
质谱分析是先将物质离子化，按照离子的质荷比进行分离，通过测量各个离子峰的强度实现分析分离的目的。质谱分析一般包括以下的几个方面：质谱检测、软件程序分析以及数据库检索。用质谱检测和软件程序分析出来的数据在数据库中进行检索与数据库中的蛋白质信息进行比对，以达到鉴定的目的。MALDI TOF/TOF质谱是由MALDI离子源和TOF飞行时间质量分析器所组成。MALDI TOF/TOF是用具有强紫外吸收的小分子有机酸作为基质，与样品与一定的比例混合均匀然后加样在不锈钢靶上形成共结晶薄膜，样品在离子源内受到激光的激发而电离，在加速电场获得动能，然后经过无电场的真空飞行管道，通过测量离子的飞行时间即可测得离子的质量。可以通过一级质谱测得糖蛋白和糖链的分子质量，也可以通过二级质谱测得肽或糖链序列。
一 糖蛋白质谱分析策略
蛋白质组LC-MS方法结合蛋白质注释数据库可以从复杂样品中鉴定到上千种蛋白质，同时通过同位素标记不同样品中的蛋白质，可以将这种方法应用于蛋白质相对定量。最近不仅将这种定量技术用于两种样品中蛋白质的差异研究，也被广泛应用于蛋白-蛋白之间，蛋白-多肽之间，蛋白-药物之间相互作用的研究。蛋白浓度是蛋白质组定量研究中一种最基本，最重要的研究参数，因为细胞蛋白质组样品中每一种蛋白质的动力学性质都与某一个细胞器中蛋白质浓度相关，而且很多生物现象都需要通过蛋白质的浓度变化来进行阐明。但是至今还没有发展出一种可以广泛应用的单独定量一种样品中蛋白质浓度的方法。以前研究中，通常用凝胶中蛋白质染色的强度来比较蛋白质的量，然而，在复杂样品中，蛋白质不可能被单一的染色，所以很多蛋白质的信息都会被丢失。因此现在在单一样品定量中加入同位素标记的合成多肽作为内标来实现，但是这种方法由于受价格昂贵和很难实现对胶内酶解蛋白质的定量的限制而没有得到广泛应用。在质谱分析中，即使一次 NanoLC-MS/MS 分析就能鉴定大量的蛋白质，还可以提供很多蛋白质的信息，比如鉴定的蛋白质级别，得分，每个蛋白质所得的多肽种类，鉴定多肽的离子数目， LC保留时间等等（这些参数都可以为蛋白质定量提供一些信息）。然而，由于质谱线性范围的限制和离子化效率的差异，不可能对质谱鉴定到的所有蛋白质定量的准确度达到一致，所以需要一种归一化的处理方法来获取更准确地定量信息。其中蛋白质丰度指数（PAI）作为一种质谱归一化的手段具有明显的优势，该指数是通过每种蛋白质正常情况下的多肽的理论数目对鉴定到的多肽数目进行归一化处理，从而达到定量分析蛋白质的目的。
本实验室发展了一种凝集素－磁性微粒复合物分离Ｎ-连接糖蛋白的方法，即利用自制的凝集素ConA，LCA，AAL，WGA- 磁性微粒复合物高通量分离糖蛋白，溶液酶解糖蛋白后用LC-ESI-Q-TOF-MS 鉴定血清中与HCC相关的糖蛋白，并利用emPAI非标记的质谱蛋白质定量的糖蛋白质组学方法。该方法主要采用两种的策略，首先利用单个凝集素-磁性微粒复合物分别分离血清中的糖蛋白并进行鉴定和定量分析，寻找肝癌相关糖蛋白的变化。其次，利用多凝集素-磁性微粒复合物分离血清中的糖蛋白并进行鉴定和定量分析，寻找肝癌相关糖蛋白的变化。这个工作流程可以实现一步纯化血清中的糖蛋白，去除血清中的高丰度蛋白质，以及分离和 Clean up的目的。
二 糖链结构质谱分析策略
糖链分析的主要方法有层析技术，电泳技术和质谱技术，这些方法各有其优缺点，其中利用质谱技术分析糖链结构受到越来越多的研究者的青睐。再利用质谱技术分析糖链中，糖链的序列和分支信息可以通过快速原子轰击质谱或者液态次级离子质谱的泛甲基化修饰的糖链的离子碎片而获得。近几年来，一些高灵敏度包括ESI-Q-TOF-MS在内的质谱可以通过较低能量的碰撞诱导解析（CID）得到非修饰的寡糖链和糖肽碎片，从而可以容易的得到飞摩水平的糖链的序列和分支信息。糖链的组成和连键情况的分析目前最好的方法是用气相质谱联用的方法分析糖链的衍生化的水解产物，但是这种方法受到分析方法灵敏度的限制。鉴于灵敏度限制，许多研究者开发了利用串联质谱分析糖链中连键位置，这些串联质谱中的高能诱导碰撞解析使糖链出现穿环断裂从而可以看到糖链之间的连键情况。而其中MALDI源配置正交加速的TOF分析器通过高能碰撞解析更是可以直接获得很多非修饰糖链和糖肽的连键信息。
MALDI源的的质谱离子片段化有多种形式存在，但由于切割位点基本相同因而产生的谱图大致相同，其主要差异是由离子化类型引起的，如[M＋H]＋，[M＋Na]＋等。主要碎片断裂形式是从糖苷键断裂，即从相邻两个糖链环中间的单键处断裂，这样的断裂方式主要是用以分析糖链序列和分支情况，但对糖链中的连键形式没有太多帮助。而需要能量高的比较少的穿环断裂则能提供更多的连键方面的信息。对糖链碎片断裂的命名方式现在研究者共用的是由Domon和 Cosetllo提出的命名法则。从还原端开始的点电荷的离子断裂依次被标记为 Ｘ 离子（穿环断裂）， Y（C１→O 糖苷键断裂）和 Ｚ （ Ｏ→Ｃｘ 糖苷键断裂）或者相对非还原端带电荷被依次标记为A，B和C离子。其中下标编号表示从还原端开始的 Ｘ ， Ｙ 和 Ｚ 离子序号或者从非还原端开始的A,B,C离子序号。在糖链的二级质谱中，所有的离子碎片中丰度最高的是Y离子和 B离子。
利用MALDI-TOF-MS分析糖链结构谱图是一种被广泛应用并且令人满意的方法来快速获得糖蛋白糖链结构信息，但注释糖链谱图并且确定质谱峰的糖链结构是必需专业的人士才能完成。糖链图谱一般都是通过象征结构或者“卡通”结构来表示糖链的拓扑学结构，这种表示方法不能显示糖链的糖苷键连接方式。虽然质谱图只能提供相对分子质量的信息，但是基于糖链生物合成的限制，还是可以确定部分可能性非常高的糖链结构。一般情况下，N-连接糖链核心区域由三个Man和两个GlcNAc组成，另外也有许多杂合型或者复杂型糖链核心结构带有一个Fuc。此外复杂糖链结构中加到核心区域的甘露糖上糖链只有 GlcNAc，Gal，Sia和Fuc，另外也会普遍存在 Lewis X三糖结构((Galβ1-4[Fucα1-3])GlcNAc）。另外可以通过其他一些附加的分析方法，如用Nano ESI MS/MS分析糖苷酶解糖链前后的差异，糖链甲基化修饰等，来进一步验证糖链结构。MALDI-TOF糖链谱图其他吸引人的特点是只需要非常少量的生物样品，获得的糖链指纹图谱可以很容易的和其他样本进行比对寻找差异，如比较两个组织，细胞系或者是两批重组蛋白质等等。目前许多在临床中应用到的癌症标志物包括肝癌标志物甲胎蛋白（AFP）都是糖蛋白， HCC对岩藻糖化的AFP的临床检测提高了检测灵敏度和特异性。另外其他一些糖蛋白如GP73作为HCC的标志物正在评估当中。由于影响肝脏组织中血液中糖蛋白平衡，因此分析蛋白质糖基化与肝脏病理学紧密相关，要分析糖蛋白就要分析与糖蛋白相关的糖链。
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