最新资料表明全世界50%以上的新发和死亡肝癌患者发生在中国，每年中国大约有30万人因罹患肝癌死亡。我国90%以上的肝癌为肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)，80%~90%的HCC患者伴随有不同程度的肝硬化。目前研究表明，在肝炎、肝纤维化/肝硬化与肝癌阶段性发展过程中患者肝组织和血清中均有糖蛋白糖链结构和数量的改变。肝实质细胞和间质细胞表面有多种糖链受体，大量糖蛋白通过其糖链部分与这些受体结合，一旦这些糖蛋白在翻译后修饰过程中发生糖链修饰紊乱，就会导致细胞功能失常，甚至出现恶性发展，产生严重的后果。已有研究表明，N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅲ(GnT-Ⅲ)，N-乙酰葡糖胺基转移酶V(GnT-Ⅴ)和α1,6-岩藻糖基转移酶(α1-6FT)在肝癌患者血清及肝癌组织中高表达，是肝癌发生后三种重要异常表达酶，能引起肝癌患者体内糖蛋白糖链结构的改变。研究也发现Siaα2-6糖链结构在肝癌组织中高表达，但在肝硬化组织中并无明显变化，可作为区分肝硬化与肝癌的依据之一。
        甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein, AFP)一种癌胚糖蛋白，在232位天冬酰胺处含有一条N-糖链。它是目前肝癌诊断的特异性指标，但AFP测定存在假阳性和假阴性的问题。约20%的晚期肝癌患者，直至病故前，AFP测定仍为阴性。近年来，与LCA(扁豆凝集素)结合的AFP-L3成为检测HCC的重要标志之一，AFP-L3实际上反映了AFP核心Fuc的变化，在其产生过程中, α1-6FT活性增强，催化Fuc转移并以α1-6键连接于GlcNAc上。尽管如此，病理组织学检查仍是目前诊断的金标准。因此，研究从肝硬化到肝癌发生发展过程中肝组织本身糖蛋白糖链的变化不但可以辅助寻找灵敏度和准确性更高的血清肝病标志物，而且为进一步理解肝病进展的糖生物学机制并研发新的治疗方法提供有价值信息。

一 肝癌/肝细胞系中糖基因表达差异分析

【本文已发表于《中国科学 : 化学 》】
        肝癌发生伴随着一系列大量异常的糖链结构的产生，这些糖链都由一系列参与糖链合成、修饰与代谢相关的糖基因表达调控。在本研究中应用糖基因芯片研究肝细胞系（SMMC-7721 ）和肝癌细胞系（chang's liver），分析两种细胞系之间差异表达的糖相关基因，整个研究过程如下图所示。

 

 

 

 

 

 

 

        杂交反应结束后芯片经过清洗用芯片扫描仪进行激光共聚焦扫描得到芯片结果。由芯片杂交结果可以看到与设计矩阵相比，十个管家基因出现阳性质控信号，而阴性质控和空白位点没有杂交信号出现，说明整个芯片质量控制体系良好。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

肝癌细胞与正常肝细胞 cRNA 芯片杂交结果

        通过 AXON 4000B 芯片扫描仪对杂交后的芯片进行数据读取，去除无效点后应用管家基因归一化法对芯片数据进行归一化处理。随后对肝癌细胞系 (Cy5) 与正常肝细胞系 (Cy3) 进行比较得到表达倍数，表达倍数大于 2 的为上调基因；表达倍数小于 0.5 的为下调基因。得到上调基因 15 个，下调基因 13 个。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

        根据芯片结果挑选 4 个基因，应用实时荧光定量 PCR 对芯片结果进行验证。

 

芯片与 Realtime-PCR （ RT-PCR) 显示表达水平的比较

        可以看出：荧光定量 PCR （ Realtime-PCR ） 检测和基因芯片结果一致，与 chang's liver 正常肝细胞系相比在 SMMC-7721 肝癌细胞系中 Alg10 和 Galnt11 的 mRNA 表达量上升，而 Galnt12 和 HMCS mRNA 表达量下降，即在 SMMC-7721 细胞系中 Alg10 和 Galnt11 上调， Galnt12 和 HMCS 下调。

 

二 经转化生长因子 - β 1 诱导的人肝星状细胞蛋白质糖基化变化的研究

【本文已发表于《Journal of Proteomics 》】

        肝纤维化是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程。目前认为，肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)，又称肝贮脂细胞(fat-storingcell, FSC)，Ito细胞等，是细胞外基质的主要来源。HSC的活化被认为是肝纤维化的中心环节。在正常肝脏中，HSC位于肝窦内皮细胞(sinusoidalendothelialcells,SEC)与肝细胞之间的窦周间隙内。其形态不规则，胞体呈圆形或不规则形，常伸出数个星状胞突包绕着肝血窦，表现为富含维生素A脂滴的静止型。当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，HSC被激活，转变为“肌成纤维细胞”，表达α-平滑肌动蛋白、合成细胞外基质等。激活的肝星状细胞一方面通过增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建，另一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高。这两类变化最终奠定了肝纤维化、门静脉高压症发病的病理学基础。LX-2细胞系是一个具有低传代性的人肝星状细胞系，来自正常人肝星状细胞在低血清(1%胎牛血清)培养条件下自发无限增值的细胞。转化生长因子-β1(TGF-β1)是转化生长因子家族的一员，具有免疫调节、胚胎发育、细胞分化、细胞外基质的形成、血细胞及血管生成等多种作用。在肝纤维化病人的肝组织和血清中均可检测到TGF-β1含量升高，同时在动物实验中，加入外源性TGF-β1可激活TGFβ1/ALK1/Smad1信号通路而诱导肝纤维化的发生。
        近来有研究指出，血清中与肝纤维化相关的α1-酸性糖蛋白可指示慢性肝病患者的病情发展，同时，在小鼠HSC活化模型中，几种糖基转移酶和糖苷酶基因的表达显示明显差异[82]。这些结果意味着肝纤维化的发生机制，即HSC的活化，与糖基化的异常表达有关。在过去的二十年里，凝集素逐渐成为糖基化研究的重要手段之一。其中，刀豆素A (ConA)、扁豆凝集素(LCA)、翅莢豌豆凝集素(LTL)、植物血凝素E(PHA-E)和植物血凝素L(PHA-L)等凝集素所识别的糖基化结构被证明在慢性肝病患者中发生了显著改变。
        本实验的目的是研究经TGF-β1诱导活化的肝星状细胞糖蛋白糖链谱的变化。首先对一些已知在经TGF-β1诱导的HSC中表达上调或下调的关键蛋白(细胞因子)上的潜在糖基化位点进行了预测；通过凝集素芯片的方法检测并比较经TGF-β1诱导的LX-2细胞系与静息态LX-2细胞系中的糖蛋白糖链谱；凝集素组化技术验证并进一步确定差异表达糖链及其在HSC细胞中的分布。结果表明，与静息态LX-2细胞相比，活化态LX-2细胞中有14种凝集素 (如AAL、PHA-E、ECA和ConA) 显示出显著增加的信号强度，而7种凝集素(如UEA-Ⅰ和GNA) 显示出显著降低的信号强度。表明经TGF-β1诱导活化的肝星状细胞确实存在蛋白质糖基化的变化，这些变化为寻找新的纤维化分子机制和抗纤维化策略提供了有效信息。
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三 肝脏癌旁组织、硬化组织和肝癌组织的糖链表达分析

【文章正在投稿中】

        该研究通过多种凝集素分别对肝脏正常癌旁组织、硬化组织和肝癌组织进行组织化学荧光染色。根据着色区域不同，肝组织可被划分为肝实质细胞和肝窦细胞，肝实质细胞和肝窦细胞又包括细胞膜和胞浆。Cy3 荧光和 Cy3 荧光标记的 BSA 分别作为阴性质控，多种凝集素的单糖抑制实验检验凝集素结合的特异性。

        根据肝脏癌旁组织、硬化组织和肝癌组织的凝集素组化结果，我们发现不同凝集素在不同组织中识别的细胞类型和细胞部位不同，信号强度的变化趋势也不同。